活性肿瘤相关循环稀有细胞（簇）检测（LCRC） ————实体肿瘤检测灵敏度95%，特异性87%，阴性预测值95%，阳性预测值97%发表时间：2021-07-29 17:31 肿瘤细胞和肿瘤相关细胞构建血液微生态环境，促进治疗抗性、生存和转移 肿瘤细胞与肿瘤相关基质细胞、免疫细胞脱落进入血液循环，大多数肿瘤细胞缺氧或受到剪切应力损伤、药物及免疫攻击，只有<0.01%的肿瘤细胞具有治疗抗性和较高的转移潜能而引起远端转移。 肿瘤细胞和成纤维细胞、巨噬细胞、血小板、髓系细胞、中性粒细胞和其它分泌免疫抑制因子的造血细胞之间存在积极的相互作用，共同构建有利于生存和转移的血液微环境 （细胞簇），形成免疫共逃逸，抑制肿瘤失巢凋亡，促进转移定植，支持肿瘤相关稀有细胞在血液循环中生存、外渗及促进在远处组织中的适应和生长。 血液微环境中，肿瘤相关成纤维细胞（CAF）通过建立强细胞粘附力，赋予肿瘤细胞剪切应力阻力，激活和维持胂瘤细胞增殖，保护肿瘤细胞免受细胞凋亡，并介导免疫抑制； CAMLS是循环中的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），调节免疫抑制，支持肿瘤血管生成和促进肿瘤细胞外渗；肿瘤相关中性粒细胞（TANS）是转移起始的介质，TANS在CTCS周围形成保护罩，避免免疫细胞的识别和破坏，进而启动肿瘤血管生成和CTCs的定植来影响肿瘤的进展。肿瘤细胞与血小板形成聚集体（ TCIPA），屏蔽NK细胞介导的肿瘤细胞溶解，赋予CTCs组织相容性复合物（MHC），破坏免疫监视，血小板衍生生长因子促进CTCS发生EMT，转分化为高度侵袭性间充质样表型。 活性肿瘤相关循环稀有细胞(簇)(LCRC) 活性肿瘤相关循环稀有细胞(簇)(LCRC)是指脱落进入外周血液中的与肿瘤发生、进展、治洽疗抗性高度相关的具有生物活性的稀有细胞尤其是细胞簇。包括循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤干细胞（CSC）、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、肿瘤相关中性粒细胞（TAN）、肿瘤相关成纤维细胞（CAF）及同型的肿瘤细胞簇（TM）和异型的由肿瘤细胞与多种非肿瘤细胞组成的混合簇（CRM）。染色体非整倍性、EMT间充质表型、CSC表型等形成稳定驱动突变和特殊表型的不同细胞亚群，获得选择性优势，代表肿瘤的可塑性、侵袭性、复发转移潜能、治疗抗性和适应性。
活性肿瘤相关循环稀有细胞簇（LCRC）在肿瘤病灶聚集形成，内渗进入血液，具有更强的耐药性和转移潜能，与不良预后直接相关，与死亡风险独立相关。细胞簇分为由肿瘤细胞群单独组成同型簇（CTM）和由肿瘤相关的成纤维细胞、巨噬细胞、白细胞、血小板等非肿瘤细胞与肿瘤细胞组成的异型簇（CRM）。 非肿瘤细胞一方面在CTC表面形成有效的物理屏障来保护CTCs免受物理剪切力和宿主免疫攻击；另一方面，构成CRM的各种非肿瘤成分相互作用，通过抑制细胞凋亡促进癌细胞増殖，释放多种细胞因子，为肿瘤细胞的生存和转移提供了有利的微环境。对于同型簇，细胞异质性（未分化与分化和MET与EMT）为远处定植提供竞争优势；对于异型簇，肿瘤细胞与其他非肿瘤细胞之间的相互作用对定植和逃避免疫监视很重要，异型肿瘤基质的存在增加了CRM内肿瘤细胞的活力，并赋予转移和治疗抗性优势。
2.5D柔性高密度微孔阵列膜微流场超滤系统 不依赖特异性细胞表面标记物和仼何驱动力，处理时间短，无损伤、低损失、高通量、高保真度捕获不同大小、形状和组成的活性、循环稀有单细胞、完整细胞簇
同步捕获不同大小、形状和组成的活性、循环稀有单细胞、完整细胞簇
高速、低细胞剪切力微流场 高途、低细胞压力微流场
高速度、高通量、高选择特异性、低剪切力、低压力微流场分 离全血分离>17mL/min>70%的标本分离（~7mL-20mL）：3min Parylene C材料，规则密排六边形微孔阵列，超高孔隙率（91.37%），高机械强度，局部3D、整体2.5D，仅在重力作用下形成高效微流场、集微流控与膜过潓双重优势，保证被捕获细胞的特异性和多样性、高捕获效率、髙通量、高速度，并保持细胞天然形态和活性。 2.5D柔性高密度微孔阵列膜微流场超滤系统的特点 ■ 捕获活细胞、活细胞簇比例大于85%
捕获细胞中活细胞比例为85-95% 肾癌CTM高效捕获（数十个），并保持微生理环境 （活细胞：绿色死细胞：红色）
心脏肿瘤患者LCRC 肾癌癌栓CTM原位培养17天 捕获释放后培养10天
2.5D柔性高密度微孔阵列膜微流场超滤系统的特点 ■ LCRC细胞结构、细胞形态、抗原表达高保真 Filamentous CK Dffuse CK Punctated CK
保留精细的细肥内结构，例如细胞骨架结构 (A) 从PBS中回收的A375细胞在微 从SMLF中回收的A375细胞在微孔 孔阵列膜上的典型荧光图像 阵列膜上的典型荧光图像 (C) 从PBS中在商用蚀刻膜上回收的 从SMLF中在商用蚀刻膜上回收的 A375细胞的典型荧光图像 A375细胞的典型荧光图像 2.5D柔性高密度微孔阵列膜微流场超滤系统的特点 ■ LCRC高回收率、低检测下限、高度线性和平行性、较高中位数
最低检测下限：10mL样品中的1个细胞 高稀有细胞回收率：80-95%
高肿瘤细胞及细胞簇检出数量，中位数（6.0个CTC/mL） 线性：R2=0.999
（A）单个样本数据显示平行样本之间的最小变异性 （A）线性回归分析得出了A管和B管样本之间极高的相关性（R2=0.99） ■ 2.5D柔性高密度微孔阵列膜微流场超滤系统的核心优势：
2.5D柔性高密度微孔阵列膜微流场超滤全方位捕获活性肿瘤相关循环稀有细胞(簇)(LCRC)，核型、表型、基因型多维度检测、分型、分析，风险评估、动态监测，服务个体化诊疗 ■ 8号染色体多倍体活性肿瘤相关循环稀有细胞及细胞簇（LCRC）检测（IF+FLSH) 癌症的特征之一是染色体非整倍体（包括整体和结构），90%以上的实体肿瘤为非整倍体。非整倍体是致癌过程中的一种驱动力，由非整倍性核型产生的表型异质性有助于耐药性和适应性，非整倍体与患者生存不良有关。 DAPI+ CEP8+ CD45-/CD45+ Merge
活性肿瘤相关循环稀有细胞（CRC）（DAPi+、cd45-、cep8>2） 活性肿瘤相关循环稀有同型细胞簇（CTM）（超过2个DAPi+、cd45-、cep8>2细胞组成的多细胞团） 活性肿瘤相关循环稀有异型细胞簇（ CRM\CTM-WBC）（超过2个DAPi+、cd45-、cep8>2细胞和cd45+细胞组成的多细胞团） ■ 活性肿瘤相关循环稀有细胞（簇）（LCRC）全活检（多重免疫荧光染色,IF)
肿瘤相关循环巨噬细胞 肿瘤相关循环成纤维细胞  肿瘤相关循环稀有细胞簇：同型细胞簇、异型细胞簇瘤 ■ 活性肿瘤相关循环稀有细胞（簇）（LCRC）表型分析、分子分型（多重免疫荧光染色，IF）
■ 活性肿瘤相关循环稀有细胞（簇）（LCRC）靶分子表达评估（多重免疫荧光染色，IF）
■ IF/FISH/NGS多平台同步检测、分析活性肿瘤相关循环稀有细胞（簇）(LCRC)
■ 基于血液、体液肿瘤相关稀有细胞（簇）（LCRC）体外培养、类器官构建、动物模型构建、NGS、单细胞测序、药敏检测、生物标志物分析、异质性研究及肿瘤发生、转移、治疗抗性机制和干预方法硏究
活性肿瘤相关循环稀有细胞（簇）（LCRC）临床应用———肿瘤患者全生命周期血液全活检伴随诊断，指导个体化精准治疗
■ 肿瘤患者分层、分级、补存分期，指导治疗 ■ 肿肿瘤患者全生命周期动态、连续、周期性监测，指导治疗 1、肿瘤负荷、侵袭性分层、分级并补存分期； 1、术后复发转移监测，早于影像学发现复发转移； 2、术后复发、转移、死亡风险精准评估，患者分层； 2、治疗抗性动态监测，早于传统方法发现治疗抗性； 3、治疗抗性精准预测、评估，患者分层； 3、遗传变异、表型及分子靶标动态监测； ■ 辅助诊断、早期筛查、癌前病变筛查 ■ 肿瘤患者全生命周期药敏检测及转移、治疗抗性靶向干预指导 1、肿瘤相关循环稀有细胞（簇）全活检，辅助判断 1、肿瘤相关循环稀有细胞（簇）体外培养药敏检测； 病灶良恶性、精准分期，指导临床诊疗策略 2、肿瘤相关循环稀有细胞（簇）药物组学检测； 2、肿瘤相关循环稀有细胞（簇）全活检，临床高危 3、转移及治疗抗性干预； 人群癌前病变筛查； 3、肿瘤相关循环稀有细胞（簇）全活检，健康人群 泛癌早期体检筛查； 活性肿瘤相关循环稀有细胞（簇）（LCRC）典型临床应用研究 ■ 8号染色体多倍体LCRC细胞、细胞簇显示化疗耐药和生存不良，胰腺癌患者LCRC>3或三倍体LcRC>3预测预后不良，化疗后三倍体比例的增加可预测化疗耐药 Detection of Circulating Tumor Cells Using Negative Enrichment Immunoflfluorescence and an In Situ Hybridization System in Pancreatic Cancer Int. J. Mol. Sci. 2017， 18， 622
■ ≥5个拷贝的8号染色体LCRC与 pathcr相关，LCRC8号染色体的非整倍性可以帮助预测直肠腺癌患者对术前CRT的反应 Aneuploidy of chromosome 8 and mutation of circulating tumor cells predict pathologic complete response in the treatment of locally advanced rectal cancer ONCOLOGY LET-TERS16:1863-1868,2018
■ 在基线时，LCRC和LcRC簇计数与较短的生存时间显著相关。在联合分析中，基线时高LCRC和LcRC簇计数的患者有较高的进展和死亡风险；动态分析表明，与无簇的患者相比，有LCRC簇的患者生存时间明显缩短；此外，具有大的LCRC簇患者的死亡风险更高 Cancer Patients Shows Circulating Tumor Cell Clusters（CTC-clusters）as Predictors o Patient Outcomes cancers 2020.12. 1111
■ LCRC簇增加了LCRC计数的额外预后价值，而较大尺寸的LCRC簇则赋予了患者更高的死亡风险。LCRC和LCRC簇在患者治疗反应和疾病进展中的动态变化，LCRC和LCRC簇的变化以更好的精度预测了风险状态，连续监测可以提高预测能力 Longitudinally collected CTCs and CTC-clusters and clinical outcomes of metastatic Breast cancer breast Cancer res Treat DOL 10.1007/s10549-016-4026-2
基线和随访LCRC和LCRC簇计数预测的患者治疗结果
基线和随访LCRC和LCRC簇变化预测患者治疗结果
在某些情况下，对于同一患者，LCRC和LCRC簇的动态变化是同步的，显著减少表示对新治疗的反应，而增加表示治疗失败和随后的不利结果（图A）。然而，在某些情况下，LCRC和LCRC簇的变化并不总是在治疗和随访过程中同时发生（图B），在开始新的联合方案后，LCRC数量显著减少，但LCRC簇的数量保持不变，影像学检查显示纵隔淋巴结减少，但在肝转移疾病中进展。相反，当LCRC簇在这个病人中再次出现时，虽然LCRC保持在较低的水平，但影像学检查显示淋巴结转移。此外，在患者死亡前两个月出现了一个大的（5细胞）LCRC簇，这意味着死亡风险显著增加，LCRC簇的大小似乎与患者的预后有关，特别是在OS分析中非常明显。 ■ 与未检出CTC-中性粒细胞 Cluster，或检出单个CTC、 CTC Cluster的患者相比，有CTC-中性粒细胞 Cluster（≥1）检出的患者无进展生存期（PFS）更短 Circulating Tumor Cell Clustering Shapes DNA Methylation to Enable Metastasis Seeding
CTC-中性粒细胞 Cluster与患者疾病预后的关系 ■ LCRC核型分析预测食管癌患者化疗敏感性及疗效，非三倍体患者对化疗的敏感性高于三倍体患者，化疗疗效与非三倍体比例呈正相关 Karyotyping of circulating tumor cells for predicting chemotherapeutic sensitivity and efficacy in patients with esophageal cancer Chen et al. BMC Cancer（2019）19:651
■ 在胰腺癌甚至癌前病变的所有阶段都可以检测到8号染色体多倍体LcRC.LCRC和CA19-9组合，胰腺癌的检出率达到100%。LCRC和CA19-9可作为胰腺癌高危人群的筛查工具 Clinical significance of pancreatic circulating tumor cells using combined negative enrichment and immunostainingfluorescence in situ hybridization Journal of Experimental Clinical Cancer Research（2016）35:66
■ 检测外周血和BALF中的8号染色体多倍体LCRC对鉴别肺良恶性病变敏感，对肺癌的早期诊断具有价值 Performance evaluation of detecting circulating tumor cells and tumor cells in bronchoalveolar lavage fluid in diagnosis of peripheral lung cancer Journal of Thoracic Disease Vol 10， Suppl 7 April 2018
■ 检测外周血和BALF中的8号染色体多倍体LCRC对鉴别肺良恶性病变敏感，对肺癌的早期诊断具有价值 分化型甲状腺癌（DTC）预后良好，转移型DTC患者（DMs）生活质量和生存时间严重降低，约30%的患者系放射性碘难治DTC（RR-DTC）。8号染色体多倍体LcRC用于早期DM检测、预后和监测治疗效果、风险分层，≥5被认为是DMs的预测指标，≥7被认为是RR-DTC的指标 Circulating Tumor Cells Correlate with Clinicopathological Features and outcomes in Differentiated Thyroid Cancer Cell Physiol Biochem 2018:48:718-730
■ LCRC可作为慢性阻塞性肺炎（COPD）患者肺癌早期（癌前）筛查的新标志物
|
